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文|辰彦语不休

(资料图片)

编辑|辰彦语不休

前言

甜瓜作为一种重要的经济蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培。随着甜瓜需求的不断增长，其在中国的种植面积也在不断增加。甜瓜集约化种植过程中的连作障碍日益严重。连作障碍可能导致相同或密切相关作物的连续作物生长减弱、产量下降、质量下降和土传病虫害增加，即使它们在正常的栽培管理下也是如此。

造成连作障碍的主要原因包括土壤理化性质的恶化、土壤微生物群落的变化、自身毒素的自毒作用等。自毒是指作物通过根系分泌物、地上浸出和植物残茬分解释放物质抑制同一植物或科植物的生长。酚酸是自毒素的主要成分。

酚酸可以通过影响植物膜系统、光合作用、酶活性、土壤微生物活性和土壤理化性质来抑制植物生长。酚酸的积累可以改变土壤微生物群落的结构，使土壤微生物从细菌转变为真菌，增加病原微生物。很难通过物理或化学方法消除酚酸。减少酚酸的积累已成为亟待解决的问题。

二、材料和研究方法

2.1. 测试材料

供试甜瓜品种为“超甜”薄皮甜瓜（长春新硕种业有限公司生产）。供试土壤样品采集自沉阳农业大学甜瓜试验保护区，分别取连作1年、2年和3年的甜瓜根际土壤。受试酚酸有阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、水杨酸、香兰素、没食子酸、原儿茶酸、香草酸、对香豆酸和芥子酸。

营养培养基（NB）：蛋白胨10g；牛肉粉3克；氯化钠 5 克；蒸馏水 1000 mL。

碱性盐培养基：KH2PO4 1.3 g；Na2HPO4 0.12克；CaCl2 0.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；K2HPO4 1克；氯化钠 0.5 克；蒸馏水 1000 mL。

筛选培养基：在碱性盐培养基中加入阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、水杨酸、香兰素、没食子酸、原儿茶酸、香草酸、对香豆酸和芥子酸。各组分终浓度为25 mg/L，固体培养基中加入琼脂粉20g。

三、菌株的分离、筛选和鉴定

3.1 菌株的分离与初步筛选

甜瓜根际土壤菌：将甜瓜根际土壤10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，充分震荡混匀后配成浓度为10-1的土壤溶液。土液静置沉淀后，取上清液1mL，分别加入浓度为10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的土液。

采用梯度稀释法制备。将各浓度土壤溶液共计100 μL加入含有十种酚酸类的固体筛选培养基板中，均匀包被。每个浓度重复3次，以灭菌水作为对照组。将培养皿置于37°C培养箱中，48h后观察结果。

甜瓜内生菌:选取甜瓜植株4个真叶期的茎叶部分，用无菌水冲洗干净，晒干。将植株剪短至1cm左右，用75%酒精和0.5%次氯酸钠分别消毒1min和5min，用无菌水冲洗3次。

将植物碎片置于研钵中，研磨成浆状，并用无菌水稀释成溶液。共计100 μL该溶液加入含有十种酚酸的固体筛选培养基板中，均匀包被。灭菌水作为对照组。所有处理重复三次。将培养皿置于37°C培养箱中，48h后观察结果。

3.2 菌株的再筛选

初级筛选后，挑取单个菌落在含十种酚酸的固体培养基上划线分离培养3-4代。然后将纯化后的菌株液化培养。

液化培养后的菌株置于离心管中，5000 rpm离心10 分钟弃上清液。用碱性盐水洗涤并稀释菌株，制备浓度为108 cfu/mL的菌液。

将菌液以5%的量接种到含十种酚酸的筛选培养基中，37°C避光振荡培养7天。对照组接种等量无菌水。

7天后，取1mL降解液过滤。通过HPLC 测定酚酸的降解率，筛选出可降解酚酸的菌株用于后续实验。

3.3 菌株鉴定

将筛选得到的菌株液化培养后，提取DNA。用超微分光光度计检测DNA浓度。

采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，检测扩增产物。PCR条件:94°C预变性4 分钟；30 个循环（94°C变性45 秒，55°C退火45 秒，72°C延伸1 分钟）；72°C终延伸10 分钟。

取10 μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将 PCR 产物送测序。将确定的16S rDNA 序列提交GenBank，Blast比对找出高同源性的模型菌株。

下载高同源性模型菌株序列，Mega软件构建系统发育树，Bootstrap值为1000。

将菌株16S rDNA序列提交GenBank获取登录号。

四、自毒素降解菌对酚酸降解作用的测定

4.1 酚酸标准溶液制备

将各酚酸标准品溶于甲醇，制成1000 mg/L的母液。将母液稀释为10-160 mg/L，过滤，4°C避光保存。

4.2 高效液相色谱条件

采用Agilent 1260高效液相色谱仪。色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18；流速:1 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：甲醇；流动相B：0.5%醋酸水；检测波长：225-329 nm。梯度洗脱:0-15分钟，30-50%A；15-16分钟，50%A；16-30分钟，50-70%A；30-40分钟，70-100%A。

2.3.3 酚酸标准曲线

根据4.1制备的标准溶液，绘制酚酸标准曲线。以标准溶液浓度为横坐标，信号面积为纵坐标。采用五点法绘制标准曲线，得出回归方程。

2.3.4 自毒素降解菌对酚酸降解作用的测定

将菌株液化培养，置于离心管离心弃上清液。用碱性盐水洗涤稀释菌株，制备108 cfu/mL菌液。

在碱性盐培养基中加入25 mg/L酚酸，50 mL放入150 mL三角瓶。每个三角瓶以5%接种量接种108 cfu/mL菌液，37°C避光振荡培养。对照组接种等量无菌水。

0、7、14和21天后，取1mL降解液过滤。HPLC检测酚酸含量，计算降解率:

降解率（%）= （Cck-Ct）/Cck ×100

Cck为对照组酚酸浓度，Ct为处理组酚酸浓度。

重复3次，取平均值。绘制菌株对不同酚酸的降解曲线。

五、盆栽实验

5.1 自毒素降解细菌减轻酚酸对甜瓜的毒性作用

为研究自毒素降解细菌减轻酚酸对甜瓜的毒性作用，我们采用盆栽实验。将未种植的葫芦科植物的土壤风干，充分混合。每盆放入5公斤土壤，以25毫克/公斤的浓度向土壤中添加10种酚酸。以加入等量不含酚酸的无菌水作为对照组（CK）。

除CK组外，每盆接种108cfu/mL细菌溶液，接种量为5%。以加入等量无菌水而不接种菌液的处理作为对照组（CKP）。本试验设6个处理，每个处理10盆。

幼苗在营养盆中培育。待甜瓜苗长到2片真叶时，选择长势和株高基本一致的移栽，每个盆中移植三株幼苗。移栽21天后，测定株高、根长、鲜重、干重和土壤中酚酸含量。

5.2 土壤中自毒素降解菌对酚酸降解作用的测定

为测定土壤中自毒素降解菌对酚酸的降解作用，我们采用高效液相色谱法。土壤样品去除杂质后自然晾干，研磨、过筛。根据道尔顿法提取土壤中的酚酸。各土样25g置于50mL离心管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液25mL。样品振摇1h，超声振荡30min，充分混匀。

静置24h后，样品以200r/min的速度振荡30min，然后以8000r/min的速度离心10min。收集上清液，用12mol/L盐酸调节pH值为2.5，使腐植酸沉淀。静置2h后，离心10min去除沉淀。将上清液4°C保存，高效液相色谱法测定酚酸的色谱条件和方法。

5.3 自毒素降解菌降解能力的稳定性检测

为检测自毒素降解菌降解能力的稳定性，我们测定了不同代培养的菌株对酚酸的降解率。菌株每3天传代一次，共传代20代。

六、自毒素降解菌的分离与筛选

根据初筛结果，共获得234株菌株。其中，甜瓜1年连作土壤分离75株，2年连作土壤分离80株，3年连作土壤分离62株，内生菌17株。从甜瓜植物中分离出来。复筛共获得9株菌，均对酚酸具有明显的降解作用。

6.1 自毒素降解菌的鉴定

为鉴定自毒素降解菌，我们采用PCR方法扩增约1500bp的产物。在凝胶成像下，电泳条带清晰，无降解痕迹。

6.2 酚酸溶液的标准曲线

根据高效液相色谱法结果，各酚酸的峰面积与其浓度之间呈良好的线性关系，可以得到各酚酸的回归方程。当各酚酸浓度在10~160mg/L范围内，该回归方程可用于以后的检测。

6.3 自毒素降解菌对酚酸的降解

随着培养时间的延长，降解率逐渐增加。4株菌株对10种酚酸均有显着降解作用。培养21天后，4株菌株对没食子酸的降解率均达100%。菌株H16和菌株T79对阿魏酸和香豆酸的降解率达100%。菌株T15对香兰素的降解率达100%。菌株T58和菌株T79对芥子酸的降解率达100%。

菌株T58在培养7天后对10种酚酸的降解效果不同，降解效果不明显。培养14天后，酚酸浓度发生明显变化，其中芥子酸的降解率最高，达63.77%。培养21天后，不同酚酸的降解率明显不同。

芥子酸和没食子酸的降解率最高（100%），其他酚酸的降解率差异显著。水杨酸的降解率为98.09%。肉桂酸和香豆酸的降解率分别为89.04%和75.35%。阿魏酸、咖啡酸、香兰素的降解率，原儿茶酸和香草酸含量在30.44%~41.77%之间，均低于50%。

结果表明，菌株T58不仅能高效降解芥子酸、没食子酸、水杨酸、肉桂酸和香豆酸，而且对其他五种酚酸均有不同程度的降解作用。

6.4 自毒素降解细菌减轻酚酸对甜瓜的毒性作用

从图中可以看出，处理组的甜瓜幼苗株高、根长、鲜重和干重均显著高于对照组CKP和CK。CKP各生理指标最低，与其他组间差异显著。T79株生理指标最高，与其他各组差异显著。结果表明，4株自毒素降解菌不仅能减轻酚酸对甜瓜的毒害作用，还能促进甜瓜幼苗的生长。在4株自毒素降解菌中，T79菌株的促生作用最显著。

6.5 土壤中自毒素降解菌对酚酸的降解

采用高效液相色谱法测试了4株自毒素降解菌对土壤中酚酸的降解效果。对照组CKP降解率为16.29%，明显低于4个治疗组。处理组中菌株T79的降解率与菌株T15的降解率无显著差异。

菌株T79的降解率明显高于菌株H16和菌株T58。结果表明，21天后对照组酚酸含量缓慢下降，而4个处理组对酚酸均有显著降解作用，降解率在77.18%~86.76%之间。表明菌株T79的降解效果最好，与实验室摇瓶培养下的降解效果一致。

6.6 自毒素降解菌降解能力的稳定性检测

测定了4株传代0-20代的酚酸降解率，随传代代数的增加开始缓慢下降。但20代降解率高于79.85%（0代降解率最低，为82.66%）。对于菌株T58、H16和T15，降解率从第0代到第15代没有显著变化，从第20代开始显著变化。

对于菌株T79，降解率从第0代到第10代没有显著变化，但从第15代开始有显著变化。但4株菌传代后的降解能力仍然较高（图5），说明4株菌株具有相对稳定的酚酸降解能力。

七、讨论

近年来，国内外学者对连作障碍的生物防治进行了研究。这些研究表明，自毒素降解菌株可以有效降解土壤中的酚酸，减轻酚酸对植物的毒性作用。

从番茄连作土壤中筛选出3株细菌，能够高效降解苯甲酸、肉桂酸和香草酸。一株从西瓜连作土壤中分离得到的菌株R30对肉桂酸的降解率高达99%，该菌株被鉴定为小杆菌属。从苹果连作土壤中筛选出的自毒素降解菌对邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸和焦没食子酸的降解率均高于50%。

从香草根际土壤中筛选得到的菌株FD-21 对水杨酸的降解率为93.62%。从人参连作土壤中筛选出5株自毒素降解菌，能够以棕榈酸为唯一碳源生长，对棕榈酸的降解率接近80%。从黄连作土壤中分离到一株能够降解阿魏酸的真菌。可在实验室条件下有效降解对羟基苯甲酸、香草酸和阿魏酸，降解率分别为58.20%、98.38% 和97.88%。

本研究从甜瓜连作土壤及甜瓜植株中筛选出4株可高效降解多种酚酸的自毒素降解菌。这与之前的研究结果一致，即许多菌株可以有效地降解具有广泛底物谱的多种酚酸。与前人的研究相比，发现很多植物的自毒素是相同的，如水杨酸、肉桂酸、阿魏酸、没食子酸等。因此，本研究的4株自毒素降解菌可能能够减轻其他植物的连作障碍。

研究表明，酚酸通常在微生物的降解作用下发生脱羧、氧化和羟基化等生化反应。分子结构中苯环上的取代基易降解转化。这些反应通常导致大分子酚酸降解为小分子酚酸或其他含有苯环的小分子有机化合物。

结论

本研究从甜瓜连作土壤及甜瓜植株中筛选出4株可高效降解多种酚酸的自毒素降解菌。在实验室条件下培养21天后，4株自毒素降解菌对多种酚酸均有明显的降解作用。盆栽试验结果表明，4株自毒素降解菌可减轻酚酸对甜瓜的毒害作用，促进甜瓜幼苗生长。这四种菌株对土壤环境中的各种酚酸均表现出良好的降解能力。4株自毒素降解菌传代后降解酚酸的能力相对稳定。

参考文献

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